دانلود با لینک مستقیم و پر سرعت .
لینک دانلود و خرید پایین توضیحات
فرمت فایل word و قابل ویرایش و پرینت
تعداد صفحات: 11
پاسخ های فیزیولوژیک سلولهای جداکشت گیاه جعفری به میدان مغناطیسی ایستا
چکیده:
سلولهای زنده دارای بار الکتریکی هستند که با یونها و رادیکالهای آزاد ایجاد میشوند. میدانهای مغناطیسی با برهمکنش با یونها و بویژه مواد فرومگنتیک نظیر آهن بر سلولهای زنده تاثیر میگذارند. میدانهای مغناطیسی از جمله عوامل محیطی هستند که میتوانند اثرات قابل توجهی را حتی در مدت زمان اندک و شدتهای پایین برروی سیستمهای زنده داشته باشند. در این بررسی سلولهای گیاه جعفری (Petroselinum crispum) در کشت تعلیقی به مدت ۴ ساعت در معرض میدان مغناطیسی mT٣٠ قرار گرفتند و محتوای آهن کل سلول، محتوای فریتین و فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی آسکوربات پراکسیداز، سوپر اکسید دیسموتاز و کاتالاز بررسی شد. بر مبنای نتایج بدست آمده میدان مغناطیسی موجب کاهش جذب آهن و بدنبال آن کاهش محتوای فریتین گشت. فعالیت آنزیمهای آسکوربات پراکسیداز نیز کاهش یافت که این کاهش میتواند نتیجه کاهش مشارکت آهن بعنوان یک واحد ساختاری در آنزیمهای فوق باشد در حالیکه فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز و کاتالاز افزایش یافت.
واژه های کلیدی: آسکوربات پراکسیداز، آهن، سوپر اکسید دیسموتاز، فریتین، کاتالاز، میدان مغناطیسی
مقدمه
میدانهای مغناطیسی از جمله تنشهای غیرزیستی هستند که حاصل عصر تکنولوژی بوده و امروزه توجه بسیاری از محققین را به خود جلب کردهاند. این میدانها هم به صورت طبیعی و هم به صورت نتیجه ای از تکنولوژی بشر امروزی، در زندگی روزمره انسان حضور داشتهاند (Belyavskaya, 2004). در مورد اثرات میدانهای مغناطیسی بر سیستمهای زنده، گزارشات ضد و نقیضی وجود دارد. از گذشتههای بسیار دور انسان به تاثیر میدان مغناطیسی بر سیستم گردش خون واقف بوده و برای درمان برخی از بیماریهای خونی از آن بهره می¬برده است (Santwani, 1981). تحقیقات دیگری نشان دادهاند که میدانهای مغناطیسی شدید باعث ابتلا به لوسمی در کودکان شده که با تخریب ملاتونین غده صنوبری همراه است (Henshaw & Reiter, 2005).گزارشهایی نیز در زمینه تأثیر میدان در عالم پروکاریوتی و نیز گیاهی وجود دارد. در٦٧٪ مطالعات انجام شده، میدان مغناطیسی، باعث کاهش درصد جوانهزنی شده است (Belyavskaya, 2004). در گیاه توتون درصد جوانه زنی بذرها، تحت تأثیر میدان مغناطیسیT ۱۵/٠افزایش نشان می دهد. جوانه زنی بذرهای کاهو تحت تأثیر میدان مغناطیسی mT۱۰-0 افزایش یافت (Aladjadjiyan , 2002). با این حال، مکانیسم تاثیر میدانهای مغناطیسی بر سلولهای زنده هنوز بطور دقیق مشخص نشده است، ولی باید گفت که اثرات مهاری یا تحریکی میدان مغناطیسی بر رشد بافتها، به عواملی نظیر گونه و اندام گیاهی، فرکانس و نوع میدان، مدت زمان تیمار و سایر عوامل تنشزا بستگی دارد (Kato et al., 1989). برخی تحقیقات نشان داده است که میدان مغناطیسی میتواند منجر به تولید و یا افزایش طول عمر رادیکالهای آزاد اکسیژن (ROS) شود. تجمع این رادیکالها میتواند منجر به تنش اکسیداتیو شود (Belyavskaya, 2004; Sahebjamei et al., 2007). تنش اکسیداتیو باعث تغییر در فعالیت آنزیمها، بیان ژن و آزادسازی کلسیم از ذخایر سلولی میگردد. همچنین این تنش میتواند بر ساختار غشا، رشد سلول و مرگ سلولها تاثیر بگذارد (Green, et al. 1999). این رادیکالها میتوانند نقش دوگانهای داشته باشند. بطوریکه از یک طرف باعث تخریب در سلول شده و از طرف دیگر خود به عنوان مولکول سیگنال باعث به راه افتادن مکانیسمهای دفاعی در سلول میشوند (Belyavskaya, 2004; Ghanati et al., 2007). میدان مغناطیسی در سطح آنزیمی میتواند باعث افزایش فعالیت آنزیمهایی چون کاتالاز، کاتالاز، پلی فنل اکسیداز، پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز شود (Pandolfini et al., 1992).
مکانیسم پیشنهادی دیگر برای نحوه عمل میدان مغناطیسی از طریق تاثیر بر مواد دارای خاصیت مغناطیسی میباشد که مهمترین این مواد عبارتند از مواد فرومگنتیک نظیر آهن و مواد دیامگنتیک نظیر نشاسته. آهن به عنوان یک عنصر ضروری برای گیاهان دارای نقش دوگانه ایست، بطوریکه از یک طرف در واکنشهای اکسیداسیون-احیا و ساختار بسیاری از آنزیمهای داخل سلولی نظیر کاتالاز، پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز شرکت میکند و از سوی دیگر از طریق واکنش هابر- وایس گونههای فعال اکسیژن تولید میکند (Dat et al., 2000). بنابراین تنظیم محتوای آهن سلولی بسیار حائز اهمیت است. فریتین از جمله مولکولهای مهم دخیل در تنظیم همئوستازی آهن میباشد که در تمام سلسلههای موجودات زنده یافت میشود (Theil, 1987; Briat et al., 1995; Chasteen and Harrison, 1999). فریتین با اکسید کردن۲Fe + به ٣Fe+، آهن را در هسته مرکزی خود ذخیره میکند (Laulhère and Briat, 1993) و همچنین به عنوان مادهای با گشتاور مغناطیسی (Magnetic moment) نامزد مناسبی جهت مطالعه برهمکنش آهن و میدان مغناطیسی در سلولهای زنده میباشد (Cespedes and Ueno, 2009). تاثیر میدان مغناطیسی mT30 بر سیستمهای زیستی در گذشته بر روی سلولهای گیاهی و جانوری مورد بررسی قرار گرفته است (Ghanati et al., 2007; Ishiwata et al., 2008). شدت میدان mT 30 به عنوان کمترین آستانه شدت میدان برای جابجایی مواد مغناطیسی در موجودات زنده معرفی شده است 2003) (Takashima et al.,.
گیاه جعفری ) (Ptroselinum crispum از خانواده چتریان (Apiaceae) میباشد که در بسیاری از نقاط جهان و ایران دارای اهمیت غذایی و دارویی است (Ozsoy-Sacan, 2006). این گیاه حاوی مقادیر بالای آهن، کلسیم، منیزیم، ویتامین C و A می باشد .(Pennington, 1985)
هدف این مطالعه بررسی تاثیر میدان مغناطیسی بر محتوای آهن و فریتین در سلولهای جداکشت گیاه جعفری میباشد. علاوه بر این فعالیت سه آنزیم آنتیاکسیدانی سوپراکسید دیسموتاز و آسکوربات پراکسیداز و کاتالاز نیز مورد بررسی قرار گرفته است.
مواد و روشها
شرایط رشد سلولی و تیمار سلولها با میدان مغناطیسی ایستا
پس از نگهداری سلولها در این محیط کشتهای مختلف و چند بار واکشت آنها، وزن کالوسها اندازهگیری شد و نتایج بدست آمده با هم مقایسه گردید. بر اساس نتایج بدست آمده، محیط کشت LS تغییریافته et al., 2007) (Sahebjamei به عنوان بهترین محیط انتخاب گردید. جهت تولید کالوس از بذرهای گیاه جعفری کشت شده در محیط کشت LS تغییریافته (محیط کشت حاوی 1-mg L 15/0 کینتین، 1-mg L 5/1 تیامین، 1-mg L 75/0 پیریدوکسین، 1-mg L 75/0 نیکوتینیکاسید، و8/5 pH) استفاده شد. کالوسهای بدست آمده از بخش هوایی چندین بار واکشت گردید. برای تهیه کشت تعلیقی حدود 2 گرم کالوس به 30 میلی لیتر محیط کشت LS مایع اضافه شد و هر 2 هفته واکشت شد.
در بررسی حاضر، سلولها در روز دهم پس از واکشت، مشابه تحقیقات گذشته (Shabrangi et al., 2011)، به مدت 4 ساعت، تحت تاثیر میدان مغناطیسی ایستا (30 میلی تسلا) قرار گرفتند. پس از اتمام تیمار سلولها برداشت شده و برای انجام آنالیزهای بیوشیمیایی در نیتروژن مایع (°C ٨٠-) فریز و نگهداری شدند.
اندازهگیری محتوای آهن کل
2 گرم نمونة گیاهی در کوره به مدت 2 ساعت در دمای C° 250 و سپس 2 ساعت در دمای C° 550 خاکستر شد. خاکستر حاصل در مخلوط اسید کلریدریک غلیظ و آب (1:1) هضم گردید و سپس روی شن داغ (C °110) خشک شد. mL5 اسید کلریدریک N1 بدان اضافه شد تا کل محتوای آهن هضم شده و آهن کل با دستگاه جذب اتمی سنجیده شد (Katyal and Sharma, 1980).
اندازهگیری محتوای فریتین
نمونههای فریز شده روی یخ در بافر استخراج ساییده شدند (Lukac et al., 2009) و با استفاده از کیت الایزا مطابق روش Flowers و همکاران (1986) مورد ارزیابی قرار گرفتند. بهطور خلاصه، g1 نمونه روی یخ و در بافر استخراج (mM10 بافر سدیم فسفات، mM100 کلرید سدیم، پلیوینیل پیرولیدین 2% و mM1 فنیلمتان سولفونیل فلوراید، 2/7 pH) ساییده و سپس در دمای°C 4 (دور g ×15000 و به مدت 10 دقیقه) سانتریفوژ شد.پنجاه میکرولیتر از محلول رویی و استاندارد به پلیتی که با آنتیبادی آنتیفریتین پوشیده شده بود، اضافه شده و بقیة مراحل بر اساس دستورالعمل شرکت پیشتاز-طب انجام گرفت. محتوای فریتین بر اساس برهمکنش آنتیژن-آنتیبادی و جذب در nm 450 با استفاده از الایزا ریدر (ELISA reader) سنجیده شد.
اندازهگیری فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز(SOD)
به منظور استخراج آنزیم سوپراکسید دیسموتاز(Giannopolitis and Ries, 1997) سلولهای منجمد شده در بافر HEPES-KOH با اسیدیته 8/7، حاوی EDTA(mM 1/0) عصارهگیری شد. همگنای حاصل در دمای°C 4 سانتریفوژ شد (×g 15000 به مدت 15 دقیقه). بخش رویی حاصل برای سنجش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز مورد استفاده قرار گرفت. عصاره آنزیمی حاصل برای سنجش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز مورد استفاده قرار گرفت و به آن بافر HEPES-KOH (mM50) با 8/7pH حاوی EDTA (mM 1/0)، 3CO2 Na (mM50) با 2/10 pH،L-متیونین (mM 12)، (NBT) نیترو بلوتترازولیوم (mM 75)، ریبوفلاوین (Mµ1) اضافه گردید. عصارة آنزیمی به مقدار مناسب یک واحد فعالیت SOD به عنوان مقدار آنزیمی درنظر گرفته شد که منجر به مهار 50 درصدی نیترو بلوتترازولیوم (NBT) در nm 560 با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتراندازهگیری شد (Sahebjamei et al., 2007).
اندازهگیری فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX)
سلولهای منجمد شده جعفری در بافر سدیم فسفات (mM 50 با اسیدیته 8/7) حاوی آسکوربات mM5، دی تیو تریتول (DTT) mM 5، EDTA (mM 5) ، کلرید سدیم (mM100) و 2 درصد (PVP) Polyvinylpyrrolidin عصارهگیری شد. همگنای حاصل در دور×g 15000، به مدت 15 دقیقه در دمای°C 4 سانتریفوژ گردید. از بخش رویی برای سنجش فعالیت آسکوربات پراکسیداز استفاده گردید. ترکیب واکنش شامل بافر سدیم فسفات mM50 حاوی کلیه ترکیبات بالا، 2O2H (µM 44) و عصاره آنزیمی به مقدار مناسب بود. فعالیت آنزیمی APX بوسیله کاهش درجذب در طول موج nm 290 با استفاده از ضریب ثابت1-1 cm - 2.8 M وبه ازای هر میلیگرم پروتئین در عصاره آنزیمی محاسبه گردید (Nakano and Asada, 1987).
اندازهگیری فعالیت آنزیم کاتالاز
مقدار mg200 از سلول جداکشت منجمد شده، در بافر سدیم فسفات mM 25 (اسیدیته1/6) عصارهگیری و مخلوط اخیر در g× 12000 و دمای C°4 بهمدت 20دقیقه سانتریفوژ گردید. از محلول رویی برای سنجش فعالیت آنزیمی استفاده شد. به Lµ 100 از عصارة آنزیمی بافر فسفات mM 25 (8/6pH ) و 2O2 H(mM 10) اضافه گردید. فعالیت کاتالاز با توجه به روند تجزیه 2O2 H و در نتیجه کاهش جذب در nm240 سنجیده و به ازای میلیگرم پروتئین عصاره آنزیمی محاسبه شد (Cakmak and Horst, 1991).
تجزیه و تحلیل آماری
کلیه آزمایشات با سه تکرار از حداقل ٣ نمونه مستقل انجام گرفت. مقایسه میانگین ها با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه ۱۶ و آزمون توکی (Tukey) جهت تعیین معنیدار بودن تفاوتها در سطح ٠۵/٠ P≤ انجام شد. ضریب همبستگی با استفاده از اندکس پیرسون تعیین شد.
نتایج و بحث
افزایش آهن در داخل سلول، از یک سو از طریق واکنش فنتون مقدار 2Fe+ و رادیکالهای آزاد داخل سلول را افزایش میدهد، که این رادیکالها میتوانند منجر به تخریب غشاها، پروتئینها و اسیدهای نوکلئیک شوند (Becana et al.,
